پایان نامه درباره عصاره هیدروالکلی، فیزیولوژی

دانلود پایان نامه

را در 200 میلیلیتر از آب مقطر مخلوط گردید ( غلظت 10%) و در ارلن 500 میلی لیتری ریخته و دور آن را با ورق آلومنیوم فویل گرفته و به مدت 48 ساعت روی شیکر قرارداده شد. بعد از 48 ساعت عصاره از کاغذ صافی رد شد و محلول به دست آمده را به وسیله آون با دمای 40 درجه سانتیگراد و به مدت 72 ساعت تغلیظ گردید. سپس عصاره به جا مانده را در یک پتری دیش خالی و استریل ریخته و در زیر هود گذاشته تا باقی مانده حلال نیز تبخیر شود و در نهایت عصاره قیری شکل بر جای ماند. مقدار 1 گرم از ماده تقریبا خشک شده را در 10 میلیلیتر آب مقطرحل شده و در ظرف شیشهای دربدار استریل شده ریخته شده و تا زمان انجام آزماش در یخچال نگهداری شد.

3-14-6-تهیه عصاره هیدروالکلی

اندام هوایی برزی کاکتوس با آب مقطر خوب شسته و تمیز شده و به مدت یک هفته در سایه خشک شده و پس از خشک شدن با آسیاب پودر گردید. مقدار 50 گرم از پودر آسیاب شده را در بشر ریخته سپس ml 175 الکل 96% و ml75 آب مقطر به آن اضافه گردید. دور آن را با ورق آلومنیوم فویل گرفته و به مدت 48 ساعت روی شیکر قرارداده شد. بعد از 48 ساعت عصاره از کاغذ صافی رد شد و محلول به دست آمده را به وسیله روتاری با دمای 40 درجه سانتیگراد و به مدت 30 دقیقه تغلیظ گردید. سپس عصاره به جا مانده را در یک پتری دیش خالی و استریل ریخته و در زیر هود گذاشته تا باقی مانده حلال نیز تبخیر شود و در نهایت عصاره قیری شکل بر جای ماند. مقدار 1 گرم از ماده تقریبا خشک شده را در 10 میلیلیتر از آب و متانول(1/1) و صمغ عربی حل شده و عصاره برای اطمینان از آلوده نبودن آن از فیلترهای 22/0 نانومتری زیر هود عبور داده شد و در ظرف شیشهای دربدار استریل شده ریخته شده و تا زمان انجام آزماش در یخچال نگهداری شد.

3-14-7-سنجش انتشار دیسک Disc diffusion

برای انجام آزمایش های ضد میکروبی توسط روش انتشار دیسک با استفاده از استاندارد نیم مک فارلند، محلولی که میزان کدورتش معادل 108×5/1 باکتری است محلول باکتری ها را برای کشت دادن در محیط مولر هینتون آگار ( MHA ) آماده می کنیم به این صورت که از قبل یک کشت خطی از باکتری ها انجام داده، که به مدت 24-18 ساعت انکوبه شده سپس مقداری از کلونی باکتری را به وسیله ی لوپ استریل برداشته و در سرم فیزیولوژی استریل حل کرده تا کدورت نمونه به اندازهی کدورت محلول نیم مک فارلند شود سپس با سوآپ استریل محلول را به هم زده و سوآپ را آب کشی کرده و آن را به محیط کشت مولر هینتون آگار انتقال داده و کشت چمنی انجام شد. بعد از کشت دیسکهای حاوی عصاره را که قبلا روی هر کدام هl 15 از هر 3 نوع عصاره را به طور جداگانه بر روی دیسک ریخته از یخچال بیرون آورد، سپس از هر کدام از عصاره ها به طور جداگانه تهیه شد و از هر کدام به مقدار هl 15 روی دیسک های خام mm 4/6 ریخته شد و در یخچال گذاشته شد.
سپس دیسک ها را پس از 30 دقیقه بیرون می آوریم و روی محیط کشت میگذاریم. فاصلهی این دیسک ها از هم حدود mm 12 است و از دیواره ی پلیت هم فاصله دارند. از مادهای که حلال عصاره مان است به عنوان شاهد منفی و از آنتی بیوتیکهای وانکومایسین و جنتامایسین به عنوان شاهد مثبت استفاده می کنیم. بعد از قرار دادن دیسک ها در پلیت را بسته و دور آن را با پارافیلم میپوشانیم و در دمای c̊37 انکوبه می کنیم.
بعد از 24 ساعت پلیت را بررسی کردیم و قطر هاله ی عدم رشد را با خط کش اندازه گیری کردیم و با توجه به جدول همراه دیسک ها گزارش تست آنتی بیوگرام را برای هر یک از آنتی بیوتیک ها به صورت حساس ( susceptible)، مقاوم( resistance ) یا نیمه مقاوم ( intermediate ) گزارش می شود. هر سنجش در این آزمایش 3 بار تکرار شد.

3-14-8-انتقال میکروب به محیط کشت

بعد از تهیه محلول هموژن، با سواپ استریل محلول را به هم زده و بعد از آبکشی کردن سواپ، (برای آب کشی، سواپ را با قدرت به دیواره لوله تکیه داده و فشار دهید تا آب آن گرفته شود) آن را به محیط کشت مولر هینتون انتقال داده و به طور کامل به وسیله سواپ، محیط کشت را به صورت چمنی کشت داده شد به طوری که هیچ محلی در محیط از قلم نیافتد.

3-14-9-آمادهسازی دیسکهای حاوی عصاره گیاهی

مقدار 20 مایکرولیتر از غلطتهای مختلف عصاره آماده شده را روی دیسکها به طور جدا گانه ریخته و به مدت 2 ساعت در یخچال نگهداری شده تا عصاره به طور کامل جذب دیسکها شود.
نحوه قرار دادن دیسک بر روی محیط کشت میکروبی
بعد از کشت، دیسکهای آنتیبیوگرام که نیم ساعت قبل از تست، بیرون یخچال قرار داده شدهاند را انتخاب و بر روی محیط کشت انتقال داده شد. قابل ذکر است که نحوه قرار دادن دیسکها در محیط کشت مولر هینتون، به صورت دایرهای است و فاصله این دیسکها از هم دیگر حدود 12 میلیمتر باشد و باید از دیواره هم فاصله داشته باشند. در ضمن فاصله این دیسکها را می توان با توجه به تجربه خود کم و یا زیاد کرد. دیسکهای مورد استفاده هم باید با نوع باکتری ایزوله شده ما مناسب باشد مثلا هیچ وقت برای باکتری گرم منفی، پنی سیلین قرار داده نمیشود چون نسبت به آن مقاوم هستند و یا اینکه آنتیبیوتیک کلروامفینیکل را برای کشت ادرار قرار نمیگیرد چون این آنتیبیوتیک نمیتواند وارد مجاری ادراری شود. بعد از قرار دادن دیسکها، درب پلیت را بسته و به مدت 24 -18دردمای37 درجه اینکوبیت شدند.

3-14-10-نحوه خواندن و گزارش کردن

بعد از 24 ساعت پلیتها را زیر چراغ بررسی و آنگاه مي‌بايد قطر هاله عدم رشد را با خط‌كش اندازهگيري کرد.

دیدگاهتان را بنویسید