پایان نامه درباره فیزیولوژی، دانشگاه شیراز، ویتامین E، عصاره آبی

شد.

3-10-3- روش آزمايش

ابتدا 200 ميلي گرم از بخش هوايي توزين گرديد. سپس 10 ميلي ليتر اسيد سولفوساليسيليك 3 درصد به هر يك اضافه گرديد. پس از 48 ساعت 2 ميلي ليتر از هر يك از محلول هاي فوق را در يك لوله آزمايش ريخته و به هر يك 2 ميلي ليتر معرف نين هيدرين (Ninhydrin) و 2 ميلي ليتر اسيد استيك اضافه گرديد . محتوي لولههاي آزمايش بمدت يك ساعت در حمام آب گرم 78 درجه سانتي گراد حرارت داده شدند. پس از يك ساعت لولهها از آب گرم خارج و در يك ظرف محتوي يخ قرار داده شدند . پس از سرد شدن، درهر لوله آزمايش 4 ميلي ليتر تولوئن ريخته، آنگاه بوسيله (vortex) بمدت 20 ثانيه مواد درون لوله هم زده شدند. در نهايت در هر لوله آزمايش دو فاز تشكيل گرديد كه از فاز فوقاني كه حاوي كمپلكس قرمز رنگ است جهت اندازه گيري پرولين استفاده شد. ميزان جذب نور در طول موج 520 نانومتر توسط دستگاه اسپكتروفوتومتر شيمادزو مدل UV-160A اندازه گيري گرديد. از محلول پرولين با غلظت هاي صفر ،‌ 40‌، 80، 120، 160،‌ 200 و 240 ميكرو مولار جهت رسم منحني استاندارد و از لوله آزمايش با غلظت صفر پرولين بعنوان شاهد (blank) براي تنظيم دستگاه استفاده گرديد.

3-11- بررسي اثر بستر کشت بر مقدار قندهاي محلول در اندام هوایی برزی کاکتوس

قندهاي محلول مطابق روش نلسون( Nelson, 1944) استخراج و اندازه گيري گرديدند.

3-11-1- مواد و محلولهاي مورد نياز

در اين آزمايش ها از محلول اتانول 70 درصد، آب مقطر، كلروفرم، معرف مس قليائي (Alkaline copper reagent) و محلول آرسنوموليبدات (Arsenomolybdate) استفاده گرديد.

3-11-2- تهيه معرف مس قليايي

5/12 گرم كربنات سديم و 5/12 گرم سديم پتاسيم تارتارات و 10 گرم كربنات هيدروژن سديم (NaHCO3) و 10 گرم سولفات سديم را در 500 ميلي ليتر آب مقطر حل كرده و سپس به تركيب حاصل 3 گرم سولفات مس (CuSO4) كه در 20 ميلي ليتر آب مقطر حل شده بود اضافه گرديد . در نهايت يك قطره اسيد سولفوريك به كل تركيب حاصل افزوده گرديد. محلول نهايي به رنگ آبي است.

3-11-3- تهيه محلول آرسنوموليبدات

5/12 گرم آمونيوم موليبدات را در 225 ميلي ليتر آب مقطر حل كرده و به محلول حاصل 10 ميلي ليتر اسيد سولفوريك اضافه گرديد. آنگاه 5/1 گرم آرسنات سديم كه در 5/12 ميلي ليتر آب مقطر حل شده بود به محلول فوق اضافه گرديد .لازم است كه محلول در تاريكي و دماي 37 درجه سانتي گراد نگاهداري شود كه رنگ آن بعد از 24 الي 48 ساعت زرد ميشود كه بعد از اين مدت قابل استفاده است.

3-11-4- روش آزمايش

200 ميلي گرم بافت گياهانيكه كشت شده بودند را در لوله هاي آزمايش ريخته و 10 ميلي ليتر اسيد سولفوساليسيليك 3 درصد به آنها اضافه گرديد. پس از 48 ساعت به 1/0 ميلي ليتر ازمحلول موجود در لوله هاي آزمايش، 9/0 ميلي ليتر آب مقطر و يك ميلي ليتر محلو ل مس قليايي اضافه گرديد و به مدت 20 دقيقه در حمام آب گرم 78 درجه سانتي گراد حرارت داده شدند . پس از سرد شدن يك ميلي ليتر محلول آرسنوموليبدات و هفت ميلي ليتر آب مقطر به هر لوله افزوده شد و توسط دستگاه همزن (vortex) بهم زده شدند.
جذب نور توسط اسپكترو فتومتر مدل UV-160A در طول موج 520 نانومتر اندازه گيري گرديد و با كمك منحني استاندارد ميزان قندهاي محلول مشخص گرديدند . براي تهيه منحني استاندارد از غلظت هاي صفر، 20 ، 40، 40، 80 و 100 ميكروگرم گلوكز در ميلي ليتر استفاده شد.بدين صورت كه يك گرم گلوكز در 100 ميلي ليتر آب مقطر حل گرديد و سپس يك ميلي ليتر از اين محلول به 99 ميلي ليتر آب مقطر اضافه شد . تا محلول 100 ميكرو گرم گلوكز در ميلي ليتر حاصل گرديد. سپس به 7 لوله آزمايش به ترتيب صفر، 2/0،‌ 4/0، 6/0، 8/0 و يك ميلي ليتر از محلول فوق اضافه گرديد و حجم هر يك با آب مقطر به يك ميلي ليتر رسانده شد و به هر لوله آزمايش يك ميلی ليتر معرف سولفات مس قليايي اضافه گرديد.سپس مراحل مختلف مانند آنچه در بالا آمده است انجام پذيرفت. از لوله آزمايش فاقد گلوكز جهت تنظيم دستگاه استفاده گرديد. در اين آزمايش براي هر تيمار سه تكرار در نظر گرفته شد .

3-12- آزمایش اثر بستر کشت بر میزان ترکیبات فنلی کل (Total phenolics)

بررسی میزان ترکیبات فنلی کل با استفاده از Folin-Ciocalteu و بر طبق روشKim و همکاران به صورت زیر انجام گرفت ( Kim et al. 2007):

3-12-1- مواد و محلول های مورد نیاز

در این آزمایش از عصاره های متانولی برگ گیاهان، متانول 100 درصد ، متانول 50 درصد، معرف Folin-Ciocalteu، بیکربنات سدیم 6 درصد و محلول استاندارد گالیک اسید استفاده گردید.

3-12-2- روش آزمایش

به منظور اندازه گیری میزان ترکیبات فنلیکل در عصاره های متانولی گیاهان، از معرف رقیق شده Folin-Ciocalteu استفاده گردید. بدین صورت که درون یک ظرف فویل پیچ شده 5 میلی لیتر معرف Folin-Ciocalteu ریخته و 45 میلی لیتر آب مقطر به آن اضافه گردید. در نتیجه معرف Folin-Ciocalteu ده بار رقیق تر شد. این محلول تا زمان استفاده در یخچال نگاه داری شد. 200 میکرو لیتر از غلظت های مختلف عصاره متانولی گیاهان که بسته به نوع گیاه بین یک تا 30 میلی گرم در میلی لیتر بودند به لوله های آزمایش محتوی 1500 میکرو لیتر معرف رقیق Folin-Ciocalteu اضافه گردیدند و نمونه ها به مدت 5 دقیقه در دمای محیط قرار گرفتند. سپس 1500 میکرو لیتر محلول 6 درصد (v:w) بی کربنات سدیم، که از طریق حل نمودن شش گرم بی کربنات سدیم در 100 میلی لیتر آب مقطر تهیه شده بود، به لوله های آزمایش اضافه گردید. نمونه ها به مدت 130 دقیقه در دمای اتاق قرا
ر داده شدند. محلول شاهد (کنترل) فاقد عصاره و محتوی 200 میکرو لیتر متانول، 1500 میکرو لیتر معرفFolin-Ciocalteu و 1500 میکرولیتر محلول بی کربنات سدیم بودند. جذب دستگاه توسط محلول شاهد (کنترل) در طول موج nm750 صفر گردید و پس از آن جذب سایر نمونه ها در طول موج مذکور قرائت شد.

3-12-3- تهیه محلول استاندارد

برای تهیه محلول استاندارد گالیک اسید، 002/0 گرم گالیک اسید در 10 میلی لیتر متانول 50 درصد حل گردید و بدین ترتیب محلول استاک 200 میکروگرم در میلی لیتر گالیک اسید تهیه شد. سپس غلظت های 25، 50، 75، 100، 125، 150 و 200 میکروگرم در میلی لیتر گالیک اسید از محلول استاک تهیه گردید و از هر یک 200 میکرو لیتر به لوله های آزمایش محتوی 1500 میکرولیتر معرف رقیق Folin-Ciocalteu اضافه گردید. نمونه ها به مدت 5 دقیقه در دمای محیط قرار گرفتند و پس از آن 1500 میکرو لیتر محلول 6 درصد بی کربنات سدیم به هر لوله آزمایش اضافه گردید. نمونه ها به مدت 130 دقیقه در دمای اتاق قرار داده شدند.
محلول شاهد (کنترل) فاقد محلول گالیک اسید و محتوی 200 میکرولیتر متانول، 1500 میکرولیتر معرف Folin-Ciocalteu و 1500 میکرولیتر محلول بی کربنات سدیم بودند که توسط آن جذب دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج nm750 صفر گردید پس از آن جذب محلول های استاندارد در طول موج مذکور قرائت شد. از مقادیر جذب به دست آمده برای رسم منحنی استاندارد استفاده گردید و سپس با استفاده از منحنی استاندارد میزان ترکیبات فنلی کل موجود در نمونه های گیاهی بر حسب میلی گرم گالیک اسید بر گرم وزن خشک محاسبه گردید. تمامی آزمایشات در سه تکرار انجام پذیرفت.

3-13-آزمایش اثر بستر کشت بر پتانسیل آنتی اکسیدانی بااستفاده از روش DPPH

تعیین پتانسیل آنتی اکسیدانی با استفاده از رادیکال پایدار DPPH بر طبق روش توصیف شده توسط Shimada و همکاران به صورت زیر انجام پذیرفت (Shimada et al., 1992 ) :

3-13-1- مواد و محلول های مورد نیاز

در این آزمایش از عصاره متانولی نمونه های گیاهی، متانول 100 درصد، محلول 004/0 درصد DPPH در متانول و محلول Trolox استفاده گردید.

3-13-2- روش آزمایش

به منظور اندازه گیری پتانسیل آنتی اکسیدانی عصارههای متانولی از محلول 004/0 درصد DPPH در متانول استفاده گردید. ابتدا محلول استاک ((stock solution تهیه گردید بدین صورت که 024/0 گرمDPPH را در یک ارلن فویل پیچ شده ریخته و سپس توسط 100 میلی لیتر متانول 100 درصد حل گردید. این محلول تا زمان استفاده در دمای نگاه داری شد. برای تهیه محلول 004/0 درصد DPPH در متانول، 10 میلی لیتر از محلول فوق را در یک ارلن ریخته و 45 میلی لیتر متانول 100 درصد به آن اضافه گردید. محدوده جذب این محلول در طول موج nm515 میبایست 02/0 ± 1/1 باشد. سپس 150 میکرولیتر از غلظت های مختلف عصاره های متانولی گیاه که بسته به نوع گیاه بین 1 تا 30 میلی گرم در میلی لیتر بودند به 2850 میکرو لیتر محلول 004/0 درصد DPPH در متانول اضافه گردید و به مدت یک ساعت در تاریکی قرار داده شدند. محلول شاهد (کنترل) فاقد عصاره و محتوی 150 میکرولیتر متانول و 2850 میکرولیتر محلول 004/0 درصد DPPH در متانول بود. دستگاه اسپکتروفتومتر توسط متانول در طول موج nm515 صفر گردید و پس از آن جذب شاهد و نمونهها در طول موج مذکور قرائت شد.

3-13-3- تهیه محلول استاندارد

برای تعیین پتانسیل آنتی اکسیدانی لازم است منحنی استاندارد رسم گردد. برای این منظور از ترولکس (Trolox) که یک آنتیاکسیدان سنتزی و دارای ساختمانی شبیه به ویتامین E میباشد استفاده گردید. ابتدا محلول استاک (stock solution) ترولکس در متانول و سپس با استفاده از متانول خالص غلظت های 25، 50، 100، 200، 300، 400، 500، 600، 700 و 800 میکرو مولار ترولکس تهیه گردید. آنگاه 150 میکرو لیتر از غلظت های تهیه شده به 2850 میکرولیتر محلول 004/0 درصد DPPH در متانول اضافه گردید.
محلولها به مدت یک ساعت در تاریکی قرار گرفتند و پس از صفر کردن دستگاه اسپکتروفتومتر توسط متانول خالص در طول موج nm515، جذب محلولهای استاندارد در این طول موج قرائت شد و با استفاده از مقادیر جذب بدست آمده، منحنی استاندارد رسم گردید.
با استفاده از منحنی استاندارد پتانسیل آنتی اکسیدانی گیاهان معادل ترولکس بر حسب میکرومول ترولکس بازاء گرم وزن خشک تعیین گردید. هم چنین درصد مهار رادیکال های DPPHتوسط نمونه گیاهان با استفاده از فرمول زیر تعیین گردید. در این معادله Ablank میزان جذب کنترل و Asample میزان جذب نمونه است.
% inhibition = (Ablank – Asample) / Ablank × 100
به منظور تعیین غلظتی از عصاره متانولی برگ گیاهان که 50 درصد رادیکال های DPPH را مهار می کند (IC50)، از نمودارهای مربوط به جذب محلول DPPH در غلظت های مختلف عصاره متانولی هر نمونه گیاهی استفاده گردید. تمامی آزمایشات در سه تکرار انجام پذیرفت.

3-14-بررسی خاصیت ضد میکروبی اندام هوایی کاکتوس برزیکاکتوس طی روشهای متفاوت

3-14-1-فهرست وسایل مورد استفاده شده برای کار میکروبی

انکوباتور
اتوکلاو
آسیاب
کلونجر
ترازو
پلیت های با اندازه های متفاوت
سواپ
دیسک های 6.4 میلی متری
انس
پنس
لوپ
لوله آزمایش
رک ( جا لولهای)
کاردک
شیکر
یخچال
سمپلر
سر سمپلر
هود معمولی
هود UV دار
سانتریفیوژ
ارلن، بشر، استوانه مدرج، جالولهای، لوله فالکون، کاغذ صافی
فیلترهای تزریق
سرنگ
پارافیلم، پنبه، پنس استریل،برچسب، ماژیک، قیچی و خط کش

3-14-2-فهرست مواد استفاده شده برای کار ضد میکروبی

اندام های مختلف گیاه پروا
نش
ماده ضد عفونی کننده
الکل 96%
سرم فیزیولوژیک
محیط کشت های مولر هینتون اگار، مولر هینتون براث
آب مقطر
گونههای میکروبی( Escherchia coli و Staphylococcus aureus) از آزمایشگاه میکروب شناسی دانشکده علوم- دانشگاه شیراز تهیه شد.

3-14-3-تهیه محیط کشت میکروبی

مواد لازم برای تهیه محیط کشت مولر هینتون آگار
مولر هینتون آگار 38 گرم
آب مقطر 1 لیتر
آماده سازی محیط کشت میکروب
مقدار 38 گرم از محیط کشت مولر هینتون آگار را در یک لیتر آب مقطر در ارلن 2 لیتری ریخته و درب آن را با پنبه به طور محکم بسته و به مدت 3 دقیقه روی شعله قرار داده تا مواد به طور یک دست در آب حل شود. سپس ارلن را درون اتوکلاو به مدت 3 ساعت قرار داده، بعد از 3 ساعت محلول را از اتوکلاو خارج کرده و قبل از اینکه سرد شود در پتریدیش های که از قبل زیر نور UV گذاشته شده و درب آنها به صورت نیم باز است، ریخته شد. محلول باید تقریبا مقدار 3/2 از پتری دیشها را پر کند. بعد از مدت نیم ساعت درب پتری دیشها را کاملا بسته و در نایلونهای فریزری گذاشته و به صورت وارونه در یخچال قرار داده شد.

3-14-4-کشت 24 ساعته

برای تهیه کشت 24 ساعته، مقدار 2-1 تا از تک کلنیها روی محیط مولر هینتون بلاد را با لوپ برداشته و به طور زیگزاک روی محیط کشت مولر هینتون آگار کشت داده سپس درب پتری دیشها را بسته و دور آن را با پارافیلم گرفته و سپس آنها در انکوباتور به مدت 24 ساعت قرار داده شد. لازم به ذکر است که تمام این مراحل زیر هود و در کنار شعله کار شده است.
آمادهسازی نمونههای باکتری

استاندارد نیم مک فارلند

استاندارد نیم مک فارلند محلولی در تست آنتی بیوگرام است که میزان کدر بودن نمونه خود را با آن مقایسه میکنیم .میزان کدورت این محلول معادل108×5/1 باکتری است. نحوه تهیه این محلول در آزمایشگاه به شرح زیر است:
5/0میلیلیتر کلرید باریم(BaCl2) ، 48/0مولار ( یعنی (BaCl2.2H_2O1.75% wt/vol به اضافه 5/99 میلیلیتر از اسید سولفوریک 36/0 نرمال( یعنی (1%wt/vol.
بعد از ایزوله کردن باکتری، مقداری از کلونی باکتری را به وسیله انس (نه لوپ) برداشته و در سرم فیزیولوژی استریل حل کرده، باید در نظر داشت که چون، در تست آنتیبیوگرام میزان کدر بودن خیلی مهم است، بنابراین در انتخاب مقدار نمونه باید دقت کرد تا نمونه را بیشتر یا کمتر از نیم مک فارلند برنداشت. اگر میزان کدورت کمتر از نیم مک فارلند باشد، مقداری دیگر از نمونه را در سرم فیزیولوژی استریل حل کرده و یا اگر میزان کدر بودن، بیشتر از نیم مک فارلند باشد در این صورت باید مقداری سرم فیزیولوژی استریل اضافه کرد تا به کدورت مناسب و برابر با نیم مک فارلند رسید.

3-14-5-تهیه عصاره آبی

اندام هوایی با آب مقطر خوب شسته و تمیز شده و به مدت یک هفته در سایه خشک شده و پس از خشک شدن با آسیاب پودر گردید. مقدار 20 گرم از پودر آسیاب شده

دیدگاهتان را بنویسید